如何觀察單細胞在復雜信號系統中的應答

 

       來自斯坦福大學的單分子研究專家Stephen Quake研究組在單分子實驗中也遇到了相同的問題，他們希望能檢測相同細胞對于相同信號的反應，之前研究人員已經利用定量PCR進行了批量分析，但是他們還是希望能就單個細胞如何對不同濃度的信號分子TNF-α產生相應的響應進行分析。

       細胞信號交流調控著基本的細胞活性以及人體中相應的細胞活動。細胞準確應答周圍環境的能力是發育、組織修復和免疫的基礎。深入理解細胞間的相互交流將有助于了解生物系統的復雜性，或能開發出癌癥，糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。

       因此Quake研究組研發了一種新方法來觀察單一細胞在細胞信號復雜系統中的應答反應，這種方法就是高通量的微流體細胞培養（high-throughput microfluidic cell culture），將這一技術與熒光顯微鏡，定量基因表達分析和建立數學模型等研究手段結合起來，Quake研究組發現相同細胞之間存在大范圍的差異，并且指出了科學家的一些認識可能已經被基于細胞群體研究的結果所誤導。

       細胞活化這一結果是一樣的，然而細胞達到結果的過程可能是不一樣的，群體研究不能顯示信息錯綜復雜的信號網絡中的差異，而這在單一細胞水平中可以觀察到。

       研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細胞，這些濃縮物是免疫系統應答炎癥或癌癥反應的代表性物質。結果發現，一些細胞接受信號并被激活，而一些細胞則沒有激活。研究人員人員觀察到細胞以不同的方式產生應答，但是細胞的基本反應在許多方面是一致的。

       這種方法的優勢是效率十分高——利用這種方法，研究人員能同時處理成百上千的細胞，并且觀察長達4天的時間里，這些細胞的反應。而缺點就是微流體實驗并不容易操作，因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測細胞對于一個信號刺激的反應，那么也許一個96孔板就能搞定，但是如果你希望了解細胞在系列環境中的反應，那么微流體實驗也許更加合適，具體來說還得看個人的情況。

 

如何分析單細胞不同時間基因表達的細微差別?

 

       來自加州大學歐文分校H. Kumar Wickramasinghe教授研究組希望能驗證基因異常表達，會導致干細胞變成癌癥干細胞這一理論，因此需要分析單個細胞生命周期中不同時間點內，基因表達的細微差別。

       在這項研究中，Wickramasinghe教授采用了一種新方法來處理mRNA，這種方法主要借助于一種十分精巧，稱為介電納米探針（dielectrophoretic nanoprobes，生物通譯）的探針，這種探針表面帶有特異性mRNA的引物。當這種探針的針尖（20nm）通過細胞膜的時候，就會產生一個電場，吸引細胞核內的分子，這樣探針收回來的時候，研究人員就能計算這一mRNA選擇性“釣”到的分子，比如在Wickramasinghe教授這一實驗中，就是癌基因表達相關的分子。

Wickramasinghe教授認為這種方法中細胞不會死亡，從而研究人員之后還能向其注入試劑，讓這一基因沉默，一個星期之后又能實時觀察細胞的具體變化了。

       這一方法的優點就是相對于其它基因組分析方法，這一方法不會破壞細胞，能進行進一步分析，而且實驗過程時間短——整個過程大約只需要幾分鐘。缺點就在于這些細胞必需是自然貼壁的，如果像成纖維細胞那樣，就要增加一步步驟進行處理。不過Wickramasinghe教授提出也許可以在浸泡在一種細胞外基質的組織培養物中對細胞進行處理。

如何提高檢測靈敏度

來自維吉尼亞州大學，伊利諾斯大學的研究人員在單細胞動力學研究方面就遇到了這種問題：細胞在移動過程（包括相互黏連，或者到細胞外基質中去）中需要借助分子力前進或者后退，研究人員希望能分析單個細胞中的這種機械力。

維吉尼亞州大學的Martin Schwartz教授研究組為此發明了一種傳感器，這種生物傳感器能在活體中測量蛋白所承受力，研究人員利用這一傳感器發現了粘著斑蛋白承受力的奧秘。

       細胞對物理力量做出響應的能力對于發育和生理來說都是根本性的，包括血液、細胞粘附和遷移的調控。難以對活體細胞中的分子力進行測量的難度限制了對此現象的研究。

       新開發的這種傳感器就是一種基因編碼的熒光張力感應模塊，該模塊能夠在活體中測量穿過特定蛋白的機械力。研究人員利用這種傳感器對粘著斑蛋白進行了測試——粘著斑蛋白是一種膜-細胞骨架蛋白，它被吸引到粘著斑上，并將細胞粘附分子（整合素）與肌動蛋白細絲相連。結果他們發現粘著斑蛋白承受力的能力決定粘著斑在力的作用下是整合還是分解。

       這種新型生物傳感器應能應用于力傳導中所涉及的其它蛋白，主要優點就是能的分析涉及的機械力，而且靈敏度高，比一般方法的靈敏度至少高100倍，也能用于檢測細胞膜表面變形情況。缺點就是蛋白接觸傳感器會改變蛋白的功能，因此研究人員需要花費較多的時候嘗試。

如何簡單快捷觀測磷酸化蛋白

來自東京大學干細胞生物學與再生醫學研究室Hiromitsu Nakauchi教授希望能了解干細胞增殖和重編程過程中的分子級聯信號，因此他分析了造血干細胞中蛋白磷酸化造成的影響。

       在這項研究中，Nakauchi教授采用了一種簡單的免疫染色技術：單細胞磷酸成像分析（single-cell imaging of phosphorylation assay，SCIPhos）。首先將大約50個細胞想排列在載玻片上，然后進行染色，通過共聚焦顯微鏡進行觀察，通過這些染色了的磷酸化修飾蛋白，Nakauchi教授可以了解哪些蛋白處于活性狀態，哪些蛋白失活了，以及這些蛋白的位置。Nakauchi教授說，“我的一些學生也利用這個方法來做Western Blotting”。

       這種SCIPhos方法的優點就是不僅僅能觀察磷酸化蛋白，而且能分析蛋白的位置，這有利于揭示關鍵的生物信息。缺點就是每個細胞需要單個成像，如果需要處理上千個細胞，那就是一個繁重的實驗了。因此這個方法比較合適分析少量的細胞，其中的小技巧就是要多注意防止水分蒸發，Nakauchi教授就是采用的在細胞液滴的周圍，用阻水筆（water-repellent pen）繞著畫一圈，這樣液滴就不會干燥得太快。

 

如何實時觀測RNA運動www.elisa17.com

     

       來自愛因斯坦醫學院的細胞生物學教授Robert Singer希望能了解mRNAs通過細胞核核孔中進入細胞質的具體過程，但是傳統的顯微技術并不能實時追蹤到這個過程，因此Singer教授想出了一個新方法，觀察活細胞中RNA的運動情況。

       首先Singer教授用黃色熒光蛋白標記mRNA分子，用紅色熒光蛋白標記核孔，通過高速攝像機將mRNA分子通過核孔的過程拍攝下來，從而揭示了mRNA分子如何通過核孔從細胞核進入細胞質的動態機制。這是研究人員*次在活細胞中實時觀察分子的膜孔轉運。這項研究也發現了與之前認知不同的結果：mRNA迅速地通過了核孔，緩慢地停泊在細胞核的邊緣等待釋放進入細胞質，具體而言是單個mRNA分子在到達核孔后會等待80毫秒，然后在5毫秒的時間內快速通過核孔，zui后分子在核孔的另一邊又等待80毫秒然后才被釋放到細胞質。

       在此之前，顯微鏡的分辨率僅為200nm，這意味著活細胞中小于這一范圍的分子無法被分辨。而通過這項新技術，研究人員將顯微鏡的分辨率提高了10倍，成功地區分了大小僅為20nm的分子。

這一方法的優點是測量精度提到了納米級，缺點是這種成像方法中用到的兩個相機拍攝必須*對齊，這并不是個簡單的工作。