細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR 中zui重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同時(shí)擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：

1）典型的引物18 到24 個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

2）選擇GC 含量為40％到60％或GC 含量與模板GC 含量接近的引物。

3）設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G 或C 的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

4）避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。在用軟件設(shè)計(jì)時(shí)大家常常會(huì)疑惑，究竟G 不能低于多少?這里有個(gè)數(shù)據(jù):G 為0~-2時(shí)，PCR 產(chǎn)率可達(dá)100%， G=-6 時(shí)，為40%。

5）避免3"末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在zui后5 個(gè)核苷中含有3 個(gè)A 或T。

6）避免3"末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’以G或C 結(jié)尾，防止AT 的松散結(jié)合引起錯(cuò)配。

7）避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。

8）引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA 分子時(shí)的溫度。兩引物的Tm 值相差不應(yīng)大于5℃。計(jì)算Tm 有幾種公式。*個(gè)公式（Wallace 規(guī)則）:Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T），這來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于15-20個(gè)堿基的引物，也適用于手工設(shè)計(jì)時(shí)的簡(jiǎn)單計(jì)算。第二個(gè)公式（Baldino 算法）適用于計(jì)算14-70個(gè)核苷酸在≤0.4mol\L 的陽(yáng)離子溶液中的Tm， 也可用于擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm 計(jì)算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41（%[G+C]）-（675/n）。以上兩種算法都是基于堿基組成而不是堿基排列而計(jì)算的，事實(shí)上相同堿基組成的引物Tm 可能差異不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一樣的，所以確定引物Tm zui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序如Primer5 等均使用近鄰分析法。

9）當(dāng)在引物5’端添加酶切位點(diǎn)時(shí)要考慮：a）該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點(diǎn)，在引物發(fā)出后才發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤的事情本人就干過(guò)，在論壇上也能看到這樣的粗心人。這樣的錯(cuò)誤會(huì)給將來(lái)的克隆造成麻煩。b）如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點(diǎn)的外側(cè)再加上保護(hù)堿基，不同的酶對(duì)于保護(hù)堿基的要求是不同的。如果不設(shè)計(jì)保護(hù)堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質(zhì)粒上，這時(shí)要注意Taq 酶的選擇，這一點(diǎn)在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5"端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm 值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。

10）有時(shí)候，對(duì)于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。特別要注意的是：不要在引物的3"端使用兼并堿基，因?yàn)?"端zui后3 個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1µM 到3µM），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板。說(shuō)了半天了，想起來(lái)還得提醒大家一句:千萬(wàn)別搞錯(cuò)了引物的位置！這句話似乎多余。

看了上面的圖吧，如果要擴(kuò)增目的序列為“ATG…………TGA”的片段，則引物分別為“ATG……”和“TCA……”仔細(xì)琢磨一下，特別是5’端再接上酶切位點(diǎn)可別搞錯(cuò)了！合成錯(cuò)了一條可就是50 塊錢，到時(shí)候挨老板批的時(shí)候別怪我沒(méi)提醒你哦：）設(shè)計(jì)好了引物就要讓公司合成，這時(shí)候別忘了談價(jià)格：）現(xiàn)在競(jìng)爭(zhēng)很厲害，價(jià)格已經(jīng)挺便宜了，注意兩個(gè)參數(shù)：一個(gè)是OD 值，如果公司說(shuō)1OD 能比2OD 優(yōu)惠，那通常1OD 足夠了。第二是純度，是HPLC 的還是OPC 的，事先要說(shuō)好，引物設(shè)計(jì)方面還有很多話題可說(shuō)，比如如何利用引物搭橋?qū)蓚€(gè)片段通過(guò)PCR 而不是酶連接起來(lái)、如果要設(shè)計(jì)引物表達(dá)蛋白時(shí)注意“N 端規(guī)則”。